基因编辑技术,除了CRISPR,还知道哪些基因编辑技术

除了CRISPR,还知道哪些基因编辑技术

ZFN

ZFN,即锌指核糖核酸酶,由一个 DNA 识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。DNA 识别域是由一系列 Cys2-His2锌指蛋白(zinc-fingers)串联组成(一般 3~4 个),每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。锌指蛋白源自转录调控因子家族(transcription factor family),在真核生物中从酵母到人类广泛存在,形成alpha-beta-beta二级结构。其中alpha螺旋的16氨基酸残基决定锌指的DNA结合特异性,骨架结构保守。对决定DNA结合特异性的氨基酸引入序列的改变可以获得新的DNA结合特异性。多个锌指蛋白可以串联起来形成一个锌指蛋白组识别一段特异的碱基序列,具有很强的特异性和可塑性,很适合用于设计ZFNs。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域(Kim et al., 1996)。FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶,只在二聚体状态时才有酶切活性(Kim et al., 1994),每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN,识别特定的位点,当两个识别位点相距恰当的距离时(6~8 bp),两个单体ZFN相互作用产生酶切功能。从而达到 DNA 定点剪切的目的。

TALEN

TALENs中文名是转录激活因子样效应物核酸酶,TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶,它借助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计识别和结合所有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割,从而导入新的遗传物质。相对锌指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)而言,TALEN能够靶向更长的基因序列,而且也更容易构建。但是直到现在,人们一直都没有一种低成本的而且公开能够获得的方法来快速地产生大量的TALENs。

CRISPR

CRISPR是生命进化历史上,细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器,简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌,利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务,细菌为了将病毒的外来入侵基因清除,进化出CRISPR系统,利用这个系统,细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的染色体上切除,这是细菌特有的免疫系统。微生物学家10年前就掌握了细菌拥有多种切除外来病毒基因的免疫功能,其中比较典型的模式是依靠一个复合物,该复合物能在一段RNA指导下,定向寻找目标DNA序列,然后将该序列进行切除。许多细菌免疫复合物都相对复杂,其中科学家掌握了对一种蛋白Cas9的操作技术,并先后对多种目标细胞DNA进行切除。以往研究表明,通过这些介入,CRISPR能使基因组更有效地产生变化或突变,效率比TALEN(转录激活因子类感受器核酸酶)等其他基因编辑技术更高。但最近研究发现,虽然CRISPR有许多优点,在人类癌细胞系列中,它也可能产生大量“误伤目标”,尤其是对不希望改变的基因做修改。

三种系统的比较

那么,可能会有人疑问了,既然如此,这三种系统的区别和联系又是什么呢?小编特意从有效性,特异性,载体性及其它四个方面,进行了一个小小的总结。

有效性

在不同的基因位点基因靶向性的有效性都是不同的,并且这也依赖于每种细胞的转染的效率。因此,只能点对点的比较靶向位点,细胞系和转染方法,这样的比较才有意义。基于我们课题组和其他课题组的ZFN和TALENs的靶向效率的实验,我们在细胞系水平上进行了比较,虽然他们可能与不同的突变特征有关。Chen的课题组的最近的研究进行了大规模的体外分析,发现TALENs在使用与上下游相关的序列的时候比ZFNs显著的具有更多的突变产生。另一个组比较了TALENs和CRISPRs在人类ESCs细胞中的情况,观察到,通过用CRISPR更换掉TALENs,在其他方面条件相同的情况下,通过产生更多的基因突变的克隆,本质上提高了效率。最近,功能上重新编码的TALENs(reTALENs)已经得到了发展,并且在人类的iPSCs细胞中的基因编辑的有效性相比较于CRISPR得到了提高。但是这个研究发现,CRISPR比reTALENs能够实现7-8倍的同源重组效率,并且其一定程度的比HE更有效率,挡雨ODN捐赠者进行比较。

特异性

ZFN和TALENs都是作为二聚体发挥作用的,其特异性是由DNA绑定的区域决定的,这个区域在每个剪切位点最多可以识别36bp。然而,在在II型CRISPR系统中的Cas9是由一种RNA引导的核酸,它的特异性是由PAM和PAM上游的20个引导核苷酸决定的。这表明,3’12个碱基的“种子序列”是最关键的,而剩下的8个碱基(非种子序列)甚至PAM序列都是可以错配的。ZFN的特异性由一种不带偏见的全基因组分析进行,并且发现存在频率低,但是可以检测到的脱靶事件的发生,其可以定义为一个高度有限的一部分。已经有研究表明,TALENs有比ZFN更低的细胞毒性和脱靶效率。
基于这个研究,TALENs诱导的CCR5特异性突变在CCR5的对偶基因上发生率是17%,而在高度同源的CCR2位点上只有1%。相反,CCR5特异性的ZFN的活性在这两个位点是相在当的,CCR5位点的突变频率是14%,而CCR2的是12%。几个研究也报告了,CRISPR/Cas系统在细胞毒性评价或者DSB诱导的检测(即,H2AX免疫染色)中都没有明显的脱靶现象。然而,最近的研究发现,CRISPR诱导的靶向不同的人类细胞的基因出现了显著的脱靶现象。例如,靶向CCR5的CRSIPR/Cas9系统偶到的在CCR2上的脱靶切除的突变率为5-20%,这是非常接近之前讨论的CCR5靶向的ZFN诱导的突变率。三个其他的小组利用更系统的方法在人类细胞中评估了CRISPR的脱靶活性,其结果表明CRISPR可能能够发生目标不匹配,从而在预测的脱靶位点上引入微缺失或者插入(插入缺失)。此外,靶向位点的定位和内涵能够显著的影响gRNA识别他们的靶向目标,而在基因组序列中的“脱靶序列”也是一样的。已经有报告说,脱靶效应能够通过小心的控制Cas9的mRNA的浓度来克服。此外,在基因编辑的时候使用配对的Cas9的切口酶已经表明能够显著的减少至少1500倍的脱靶活性。

病毒为基础的传递

ZFN基因可以通过慢病毒和腺病毒进行传递。当前,ZFNs导入体细胞是通过共转染两个慢病毒载体,每个载体编码一个功能性异源二聚体对的一个单体。相反,腺病毒,但不是基于HIV的慢病毒,载体使用与TALEN的基因的传递,因为TALENs的大尺寸和TALE重复序列的种应用。Cas9也是一个较大的基因,并且其酶促死的版本也可以通过慢病毒进行传递,虽然也盛行的Cas9的稳定的表达对于细胞的毒性依然是不清楚的。

其他方面

ZFNs和TALENs都能够在切割时产生粘性末端,因此可以使用标签绑定,如果具有互补突出部分的双链寡聚核苷酸(dsODN)是可以进行预测的。ZFNs和TALENs都可以在捐赠的质粒的基因组中引入同一个核酸靶向位点来实现。ZFNs和TALENs通过采取同源二聚体的方式从而获得优势,绑定门通过设计实现了重组(Ob-LiGaRe)。这种方法在使用的质粒中倒置了两半的核酸酶的结合位点,这是在没有改变接头区的方向实现的,因此通过相同的ZFN/TALEN碱基对能够阻止连接产物的消化。因为CRISPR产生了一个非粘性末端,直接连接会遇到挑战。最近的文章表明,具有Cas9n的gRNAs的碱基对能够诱导具有徒步部分的DSBs,并且促进dsODN的高效率的NHEJ介导的插入。虽然至今还没有出版,但是进入的转基因大小的DNA能够通过引入在目标质粒的CRISPR/Cas9靶向位点的具有CRISPR/Cas的基因组使用。CRISPR/Cas系统相比较于ZFNs和TALENs具有几个优势,例如易于构建,花费低,并且产物具有可扩展性,并且能够用于多个靶向基因组位点。
什么是基因编辑技术

基因编辑技术就是佳学基因的无损基因校正技术。佳学基因通过基因解码基因检测,发现引起人的肿瘤、重大 疾病、不孕不育的原因,然后对将致病基因进行剪切、修改的技术。
对基因编辑技术的应用进行收益风险分析?

基因编辑技术是指基于突变原理对基因组固有序列进行原位精确修饰,在人口健康、农业育种和工业生产等方面发挥了重大作用。据Kalorama Information估计,2016年,基因编辑工具、试剂、服务、模型和其它相关供应市场规模达6.08亿美元。

 

一、基因编辑技术的发展过程

 

基因组编辑技术的发展历史可以追溯到1951年,沃森和克里克发现了 DNA双螺旋结构,使得对DNA进行人工改造成为可能。随后在1979年,Scherer 和Davis实现了外源基因的正常表达,这标志着基因组编辑技术的正式形成。

 

目前主要的基因编辑技术有锌指核酸酶技术(ZFN)、转录激活因子样效应物 核酸酶(TALEN)、规律成簇间隔短回文重复(CRISPR-Cas9)等,其中CRISPR 技术是目前最新也最为通用的基因编辑技术,其成本低廉,简单易用,只需花 费60美元就可以购买到CRISPR技术所需的基本材料,网络上甚至有免费获得这些材料的途径。CRISPR已经在人类和其它哺乳动物细胞中成功进行了位点特异性的DNA切割,未来有望解决一些人类相关疾病;在商业上,已经用于多种转基因农作物中,利用该技术可以将转基因作物的相关外源基因,在发挥作用后敲除,有望使转基因食品更加安全。

 

二、基因编辑技术的发展现状和趋势

 

基因编辑技术广泛应用于微生物基因编辑,植物基因编辑、动物基因编辑和人体基因编辑等领域,各国纷纷开展相关研究。从基因编辑相关科学论文的 数量来看,美国占全球的50%左右,具有压倒性优势,中国、德国、日本次之。 从专利来看,1993年?2014年间,全球提出的专利申请里美国占54.5%,中国占18.8%,欧洲占18.4%,日本占3.3%。从应用领域来看,基因疗法成为关注热点。目前,全球有大量研宄团队正使用基因编辑技术推进基因疗法,多个以CRISPR技术为基础的初创公司正向临床应用努力,很多制药巨头也参与进来。美国再生医学联盟的统计显示,仅2017年第一季度,全球基因疗法领域投资超过10亿美元。

 

基因编辑技术目前研究最多的是在人类疾病治疗中的应用,其最终的目的就是通过改变基因结构来达到疾病的预防和治疗。据世界卫生组织预测,引起 人类遗传病的单基因突变就达1万种以上。如果临床应用最终被证明为安全有效,以治疗为目的的人类胚胎基因编辑将大有可为。近年来,基因编辑取得一系列突破性进展。2014年全球首只靶向基因编辑猴子在中国出生。2015年4 月中国科学家首次修改人类胚胎基因。2016年华西医院宣布首例基因编辑人体 实验正式开展。随着科学家对疾病致病机理和基因编辑越来越深刻的认识以及对基因编辑方法的不断改良,基因编辑最终会从实验室走向临床的广泛应用。

 

三、基因编辑技术的风险和各国的态度

 

由于基因编辑技术能改造出新的生物体,因此存在一定的误用和滥用风险,主要集中在伦理和安全上。2017年8月,英国广播公司在其网站发表文章, 列出了2050年前人类将面临的十大挑战,其中基因编辑技术位列首位,认为该技术会给人类带来伦理等诸多方面的挑战。

 

基因编辑技术存在的风险

 

技术自身存在风险

 

作为一项技术,基因编辑还存在不完善和不成熟之处。2017年8月,CRISPR 发明人之一、华人科学家张锋团队指出,不同个体间存在巨大的遗传变异,这些变异可能会影响CRISPR的精确编辑。

 

可能存在伦理问题

 

基因编辑技术在临床上的应用引发了人们对伦理问题的担忧,目前伦理上争议较大的是人类胚胎基因编辑,不同的国家对人类生殖细胞基因编辑态度不同。根据2014年一项研宄显示,在全球39个国家的调查中,有25个国家反对人类生殖细胞基因的修饰,并通过法律来执行这项禁令,其中包括了加拿大、 澳大利亚、英国以及法国等。另有4个国家已通过文件禁止这类研宄进行,但未立法,这其中包括中国。而俄罗斯在内的9个国家对人类生殖细胞基因修饰的态度不明确。美国限制人类生殖细胞基因修饰。

 

或对国家安全造成严重影响

 

基因编辑技术可以用来发明新的病原体,如果这些病原体发生泄露、或是被用作生物武器,将会造成严重损失。站在国家的立场来看,一种新的技术出现时,它总会想到这种技术不好的一面,可能有什么负面的影响或者潜在的威胁,可能会就此作出一些防御性战略。为此2016年2月,美国情报界年度全球威胁评估报告中,将基因编辑技术列入“大规模杀伤性与扩散性武器”威胁清单。

 

各国的态度

 

重视伦理问题

 

2017年2月15日,人类基因编辑研究委员会正式就人类基因编辑的科学 技术、伦理与监管向全世界发布研宄报告,提出人类基因组编辑监管的7个一 般性原则以及若干建议,要求重视伦理和监管问题。2017年8月,全球11个开展基因研究相关工作的机构组成的国际团体就人类生殖细胞基因编辑研究联合声明,反对把这项技术用于生殖目的,但支持公共资本注入以探究其潜在的临床应用价值,呼吁世界各国也应该决定伦理上如何操作。中国科学家及研究机构没有参与此次声明。

 

加强监管

 

2016年7月,美国国防部高级研宄计划局(DARPA)启动的“安全基因” 项目将开发一套工具,用于解决基因编辑技术这一快速发展领域的潜在风险, 避免或限制经过工程改造的基因发生扩散。2017年1月,美国食品药品管理局发表一份监管草案,打算把基因编辑分为三个类别监管,分别是基于体细胞编辑的人类医学产品、基因编辑植物衍生食品和动物衍生食品,其中动物的基因组被修改部分将视为新药接受严格监管。

 

四、结语

 

迅猛发展的基因编辑技术正在给我们的生活带来巨大的变化,在享受先进科学技术带来的种种福利的同时,我国在核心技术的创新以及相关的伦理学和法律法规监管等方面还应进一步加强,以确保这一先进技术得到正确而有效地应用。

 

来源:《生物安全科学动态监测快报》2017年第18期

韩春雨基因编辑技术真的厉害吗

一项DNA编辑技术是否有优势涉及到方方面面。从目前的情况来看,NgAgo的优势很明显,主要体现在
1)反应效率不低(不说高,但不低)
2)特异性较好(但有人引用说因为gDNA比Cas9的gRNA 长5nt,所以精确度提高1024倍,这个“理论上”的4^5不得不说是噱头,因为脱靶率(精度)不是这个意思,这样外行的计算是不该的)
3)不依赖PAM
4)NgAgo本身分子量不大

另外还有一些文章中作为优势,但也可能是劣势的性质(比如使用ssDNA介导,提高特异性同时会带来很多问题)不论如何优势是明显的,但是仅仅这些方面并不够,还需要研究更多问题,比如特异性好是有限实验基础上的理论结论,实际应用脱靶率如何要看具体情况。

目前来看有几项事关这项技术未来的、优先待验证的问题是:
1)系统正交性
2)多位点编辑能力
3)NgAgo蛋白的模块化程度(工程化改造的潜力)
4)ssDNA的通用性和缺点

不要小看上述问题,条条都是卡脖子的,一条不给力就会被CRISPR比下去。很多人知道CRISPR很火,也知道CRISPR是很好的基因组编辑工具,容易以为基因编辑工具本身是很牛的,实际上CRISPR之所以火,还有很大一部分原因在于高正交性、高通用性、高工程化潜力带来的广泛应用,诸如转录后调控、人工TF等等。核酸定点内切是一个基础性质,带来了上述性质的可能性,需要经过验证才能就是否可以作为CRISPR的替代技术有一个结论。

比如在不同物种细胞系统中的正交性如何?目前知道Ago在真核到原核细胞中广泛存在同源基因,这个在文章中是作为某种优势来讲的,但实际上可能是一个劣势。因为正交性问题,在人类细胞中好用未必在其它物种平台中好用。大家可能注意到了,文章开篇第二个实验就是做了一个简单的正交性测试,测试结果还不错,文中提到
which implies that there is very limited 5 ′ phosphorylated ssDNA present in human cells, suggesting that endogenous ssDNAs will not mislead NgAgo to off-target sites
这当然不足以说明NgAgo具有高正交性,作者也用了implies的措辞,还有待进一步证实。可以从文中看出,作者最担心的问题其实也是系统正交性,在文章最后,作者特意强调需要进一步的高通量实验来研究这个问题,可见作者并非没有意识到,而是受限于时间或其它科研条件。

除此之外,多位点编辑能力是CRISPR的一项重大优势。我们现在知道NgAgo和ssDNA的结合是非常稳定的(在37℃条件下不可逆),这当然是某种提高特异性的优势,但稳定也是双刃剑,有可能成为劣势。文中提到:
similar to mammalian Ago2, which cannot exchange its bound oligos with free oligos at 37 °C
这样的性质是否会影响到NgAgo在多位点编辑中的反应效率不得而知。我看到大部分评论都没有提到这个问题。

CRISPR还有一个亮点是Cas9的模块化性质。可以容许进行较多的蛋白工程改造,NgAgo是否有这样的高度模块化的性质也将直接决定这项技术能否问鼎优秀DNA编辑技术的地位。如果对蛋白质工程设计的可扩展性不好,那么其应用很有可能受限。

最后还有ssDNA在各种细胞平台中如何使用等问题,我们现在知道CRISPR系统常导入gRNA或通过sgRNA transcription vector来制造介导核酸,DNA显然不能用这招,直接导入DNA本身就限制了NgAgo在一大类物种当中的应用潜力。有同学展望天然的5″p-ssDNA的加工机制未来可以利用,然而文章中提到人类细胞中5″p-ssDNA并不丰富。这有利于系统正交性,却也暗示ssDNA的使用有可能成为这项技术的一个瓶颈。有一位答主说ssDNA的用量只要CRISPR技术中RNA用量的1/10,这显然是英文不好造成了误读,文章中原文是:
if the sgRNA is expressed from a plasmid and the normal dosage of an ssDNA guide is only ~1/10 of that of a sgRNA expression plasmid
可见,特异性ssDNA在这项实验中是可以通过使用浓度饱和来增强NgAgo的特异性的(与破坏正交性的ssDNA竞争性结合NgAgo),但是这个robustness是一柄双刃剑。DNA分子本身的稳定性、系统的鲁棒性和使用方式会影响这个系统的可控性。一旦系统可控性不好,基本上会被最重要的生物医疗领域排除在外。